Colorações

Coloração de Gram: esse método é capaz de distinguir diferenças importantes entre as bactérias, principalmente quanto à permeabilidade de sua membrana e nos componentes de sua superfície. Apresenta-nos a célula bacteriana de acordo com a sua morfologia e, conforme os componentes de sua membrana, a coloração evidencia as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

Método: Primeiramente devemos fixar o esfregaço com calor e em seguida cobrir com cristal violeta. Lavar com água sem deixar que se formem poças e cobrir com iodo de Gram, então lavar tomando o mesmo cuidado. Após isso se deve descorar durante 30 segundos com suave agitação em acetona (30mls) e álcool (70mls). Lavar novamente e cobrir com safranina durante (solução a 2,5% em álcool 95%). Lavar por uma última vez e deixar secar para posterior análise microscópica.

Coloração de Ziehl-Neelsen: é método de coloração especial para bactérias ácido-resistentes, que se refere a bactérias capazes de resistir muitas substâncias químicas, pois possuem um envoltório céreo que só consegue ser penetrado pelos corantes quando são aquecidos ou tratados com detergentes. Exatamente por esse motivo que devem ser coradas por um método específico. Dessa forma, a realização da metodologia de Gram nesse caso se torna irrelevante.

Método: Primeiramente devemos fixar o esfregaço com calor; cobrir com carbolfucsina e secar suavemente com chama direta durante cinco minutos. Lavar com água e descorar com ácido-álcool até permanecer apenas uma coloração rósea-pálida, então lavar novamente. Contracorar com azul de metileno de Loffler, em seguida lavar e deixar secar para posterior análise microscópica.

BROOKS, Geo F.(et al), Microbiologia Médica, 24.ed; Rio de Janeiro: MacGraw-Hill, 2009.

Bactéria “gigante”: algumas espécies são visíveis a olho nu

Se você achava que bactéria era sinônimo de “ameaça invisível”, lamento informar que você não está de todo certo.

De fato, a maioria das bactérias é minúscula, muito pequena para ser vista a olho nu. Há boas razões para isso: enquanto as células complexas das plantas e animais têm sistemas de transporte internos para mover moléculas ao redor, as bactérias se baseiam principalmente na difusão para mover coisas ao redor de suas células. Uma vez que a difusão só funciona bem em distâncias de até alguns milionésimos de metro, as bactérias não podem crescer muito.

No entanto, algumas espécies conseguiram realizar a façanha. Na verdade, pelo menos três são tão grandes que podem ser vistas sem ajuda de um microscópio.

A primeira gigante foi descoberta em 1985, mas devido ao seu tamanho, não foi reconhecida como uma bactéria até oito anos mais tarde. A Epulopiscium fishelsoni (na foto) tem a forma de bastonete, vive no intestino de peixes-cirurgiões no Mar Vermelho, e chega até 0,7 milímetros de comprimento (o que é centenas de vezes maior do que, por exemplo, a bactéria E. coli que mora no nosso intestino e tem cerca de 0,002 milímetros de comprimento).

A E. fishelsoni alcança esse tamanho “máximo” por ter dezenas a centenas de milhares de cópias de seu DNA.

Isso significa que ela pode produzir proteínas em muitos lugares diferentes em sua célula, de forma que elas só precisam se difundir a uma curta distância para chegar até onde são necessárias. Cálculos recentes mostram a proporção de DNA por volume na E. fishelsoni é o mesmo para uma bactéria de tamanho normal.

A E. fishelsoni manteve o título de maior bactéria até 1997, quando Thiomargarita namibiensis apareceu para concorrer na categoria.

A T. namibiensis, que significa “pérola de enxofre da Namíbia”, por causa dos grânulos de enxofre brilhantes que moram dentro dela, chega a até 0,75 milímetros de diâmetro.

A bactéria conta com o mesmo truque de E. fishelsoni: milhares de cópias de seu DNA. Embora tenha um volume até 100 vezes maior do que a E. fishelsoni, a maior parte deste espaço é usado para armazenamento: 98% da célula é ocupada por uma membrana enorme, ou vacúolo.

Este vacúolo contém até três meses de fornecimento de nitrato, que a bactéria usa para oxidar o sulfeto de hidrogênio do qual se alimenta. O armazenamento é necessário porque o fornecimento de nitrato no fundo do mar é irregular, dependendo de animais mortos que afundam.

Uma bactéria quase idêntica a T. namibiensis, com 0,5 milímetros de diâmetro, também visível a olho nu, foi descoberta no México em 2002. Isso prova que provavelmente há mais bactérias gigantescas por aí, esperando para serem encontradas

BIBLIOGRAFIA:

www.hypescience.com

Acadêmica: Karen Quevedo

LISTERIA

As listérias são bastonetes Gram-positivos, não esporulados, anaeróbios facultativos, e é um patógeno intracelular, que não coram pela coloração do ácido rápido e apresentam flagelos; elas foram classificadas como “Listerella”, e depois modificado para Listeria em 1940.
As listérias se assemelham ao gênero Brochothrix. Ambos os gêneros são catalase-positivos e tendem a estar associados ao outro na natureza, assim como o Lactobacillus. Todos os três gêneros produzem ácido láctico a partir da glicose e de outros açúcares fermentados, mas os lactobacilos são catalase-negativos. Em certo momento as listérias foram colocadas na família Corinebacteriaceae, mas atualmente estão relacionadas à Bacillus, Lactobacillus e Streptococcus. A partir da seqüência de RNA ribossomal 16S, a Listeria está classificada próximo a Brochothrix, e estes dois gêneros, juntamente com Staphylococcus e Kurthia, ocupam uma posição entre o grupo dos Bacillus e dos Lactobacillus/Streptococcus dentro da ramificação Clostridium-Lactobacillus-Bacillus, onde a porcentagem de G+C de todos esses membros é inferior a 50%. Transferências genéticas ocorrem entre Listeria, Bacillus e Streptococcus, e reações imunológicas correm entre Listeria, Stphylococcus e Lactobacillus.
Listeria spp. contêm ácidos teicóico e lipoteicóico, assim como bacilos, estafilococos, estreptococos e lactobacilos, mas diferentemente destes grupos, suas colônias brilham quando visualizadas por luz transmitida obliquamente.
As listérias estão amplamente distribuídas na natureza e podem ser encontradas em vegetação deteriorada, solos, fezes de animais, silagem, esgotos e água. Em geral, podem ocorrer em locais onde bactérias corineformes estão presentes. Sua associação com certos produtos lácteos e silagem é bem conhecida, assim como a associação desses produtos de ácidos lácticos.
Oito espécies estão relacionadas ao gênero Listeria - L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. denitrificans, L.murrayi e L.grayi-, o mesmo tem sofrido constantes alterações taxonômicas. A espécie L. denitrificans foi reclassificada como Jonesia denitrificans e, recentemente as espécies L. grayi e L. murrayi foram agrupadas em uma única espécie, Listeria grayi. A espécie ivanovii, por sua vez, foi subdividida em duas subespécies: L. ivanovii subsp. ivanovii e L. ivanovii subsp. landoniensis. Mas a principal espécie patogênica e de importância para a microbiologia de alimentos é a Listeria monocytogenes.
A Listeria monocytogenes foi descrita pela primeira vez em 1911, desde então ela tem sido apresentada como um patógeno de mais de 50 mamíferos, incluindo humanos, e de aves silvestres, peixes e crustáceos. O primeiro caso de listerose humana, patologia provocada pela presença de Listeria, foi relatado em 1929, mas foi na década de 80 que se tornou um dos mais importantes patógenos veiculados por alimentos, isso devido à eclosão de diversos surtos de listerose humana.
A Listeria monocytogenes é um bacilo Gram-positivo, não formador de esporo, anaeróbio facultativo. E leva o nome de monocytogenes por apresentar atividade produtora de monócitos. Onde as células jovens, quando observadas no microscópio, apresentam-se na forma lisa, assemelhando-se a pequenos difteróides, medindo de 1,0 a 2,0μ por 0,5μ. Após três a cinco dias de incubação, no entanto, apresentam-se como bacilos longos, medindo de 6 a 20μ. O número de células presentes nos alimentos para que ocorra seu crescimento irá depender do tipo de alimento, e as taxas de prevalência podem variar de 105 a 108. Ela é móvel devido a flagelos peritríquios, apresentando movimentação característica chamada de tombamento, que auxilia na sua identificação. Apresenta catalase positiva e oxidase negativa.

Sabe-se que a L. monocytogenes pode ser encontrada em alimentos frescos de origem animal ou vegetal. Em geral, o microrganismo tem sido encontrado em leite cru, queijo mole, carnes frescas e congeladas, frango, frutos do mar, frutas e produtos vegetais. A prevalência em leite e laticínios tem recebido maior atenção devido aos primeiros surtos, que ocorreu na Escócia durante mais de um ano, onde 260 fazendas que continham tanques de leite cru. Onde foram analisadas diversas amostras onde 25 das 160 amostras foram positivas. Dos 5.779 alimentos analisados na Holanda, em 1988, 3,0% foram positivos. Nos EUA, em um período de 39 meses, 7,1% das 1.727 amostras de carne de gado foram positivas para L. monocytogenes.
Em estudos epidemiológicos, são importantes os esquemas de sorotipagem e fagotipagem. O esquema atual de sorotipagem de Listeria baseia-se na identificação de 15 antígenos somáticos (O) e cinco flagelares (H), sendo 16 sorovariedades reconhecidas para as cinco espécies do grupo um: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. ivanovii subsp. ivanovii e L. ivanovii subsp. Landoniensis e L. welshimeri. O grupo dois é composto pela espécies Listeria grayi contém antígenos O e H específicos. Atualmente, existem 27 fagos para tipificação de L. monocytogenes.
Além da sorotipificação, muitos outros métodos têm sido aplicados para a caracterização de espécies e subespécies de L. monocytogenes. Entre os vários métodos, estão a tipificação por bacteriófagos, a tipificação por eletroforese com enzimas multilocus, análise por enzima de restrição, a eletroforese em gel de campo pulsado, fragmentos de restrição de tamanhos polimórficos de DNA e a tipificação ribossomal.

1.1 Crescimento

As necessidades nutricionais das listérias são típicas das bactérias Gram-positivas. Elas crescem bem em meios comuns como BHI, caldo triptona e caldo tripticase-soja. Embora muitas das necessidades nutricionais tenham sido descritas para L. monocytogenes, acredita-se que as demais espécies tenham necessidades similares. Pelo menos quatro vitaminas do complexo B são necessárias- biotina, riboflavina, tiamina e ácido tioctico-, bem como os aminoácidos cisteínas, glutamina, isoleucina e valina. A glicose aumenta o crescimento de todas as espécies, e vários outros carboidratos simples ou complexos são usados. A Listeria ssp. assemelha-se aos enterococos por ser capaz de hidrolisar esculina e crescer na presença de 10 a 40% de bile, 10% de NaCl, 0,025% de acetato de tálio e 0,04% de telurito de potássio, mas, diferentemente dos enterococos, ela não cresce na presença de 0,02% de azida de sódio. Ao contrário da maioria das bactérias Gram-positivas, as listérias crescem em ágar MacConkey. Embora o ferro seja importante para o crescimento in vivo, a L. monocytogenes aparentemente não possui composto ferro-específico, obtendo o que necessita por meio da mobilização de ferro livre reduzido, o qual se liga a receptores de superfície.

1.1.1. Efeito do pH

O pH ótimo para crescimento para o crescimento desta bactéria está entre 6 e 8, ela pode crescer em uma faixa maior, entre 5 e 9. Em meios de cultura, já se verificou seu crescimento em pH 9,5. Ambientes com pH inferior a 4,5 e superior a 9,5 são considerados hostis a L. monocytogenes. Mas existem relatos de crescimento em meio de cultura com pH de 4,4.
Em geral, o pH mínimo de crescimento de uma bactéria varia em função da temperatura de incubação, composição dos nutrientes, atividade da água e presença e quantidade de NaCl e outros sais inibidores.

1.1.2. Efeito de temperatura

L. monocytogenes apresenta crescimento na faixa de 2,5°C a 44°C, embora existam relatos sobre o crescimento a 0°C. Este microrganismo suporta repetidos congelamento e descongelamentos. O tempo de geração a 35ºC varia conforme o meio em que se encontra. Em meio de cultura de ágar tripticase-soja o crescimento de 78 linhagens de L. monocytogenes ocorre dentro de uma faixa de 0,5ºC a3,0ºC.

1.1.3 NaCl

Com relação à concentração de NaCl, contatou-se a sua sobrevivência em 10,5% incubada a 37ºC por 15 dias e 10 dias, respectivamente. Em concentrações de 20%-30% de NaCl, o tempo de sobrevivência foi reduzido para cinco dias. Mas, se a temperatura é reduzida para 4ºC, a bactéria pode sobreviver por mais de 100 dias em concentrações entre 10,5% e 30,5% de NaCl. Existe uma interação do Ph com o NaCl e a temperatura.
Em estudos foram observados crescimentos em pH de 4,66 o tempo para crescimento visível foi de cinco dias a 30ºC,sem adição de NaCl; oito dias, a 30ºC, com 4% de NaCl; e 13 dias, a 30ºC, com 6% de NaCl. Crescimento a 5º ocorreu somente após nove dias em pH 7,0 sem adição de NaCl; com adição de 4% de NaCl, em 15 dias foi observado crescimento; e com 6% de NaCl, foram necessários 28 dias. Os efeitos do pH e do NaCl foram determinados por serem puramente aditivos e, em nenhum momento, sinergéticos.

1.1.4. Efeito de Atividade da água

A atividade de água ótima para que ocorra crescimento é próxima a 0,97. Mas esta bactéria consegue se multiplicar em atividade de água considerada baixa para a multiplicação de patógenos, 0,92. Existem relatos de sobrevivência de L. monocytogenes a 4ºC por pelo menos 132 dias em caldo de tripticase de soja contendo NaCl na concentração de 25,5%, com atividade de água de 0,83 aproximadamente.

1.2. Características da doença.

É no intestino humano o ponto de entrada da L. monocytogenes no organismo, através das células epiteliais do ápice das microvilosidades. Onde se difundem, não só pelo interior desta célula como também de uma célula para outra. Na fase seguinte, são ingeridas por macrófagos, mas isso não significa uma resposta inflamatória significante. Uma vez as células de L. monocytogenes dentro dos macrófagos ficam protegidas dos leucócitos polimorfonucleares.
Estudos demonstraram que cepas virulentas são capazes de multiplicar-se em macrófagos, que são rompidos e produzem septicemia. Com isso o microrganismo pode atingir outras áreas do organismo, podendo envolver o sistema nervoso central, coração e outros locais. Em mulheres grávidas pode haver invasão do feto, aborto dependendo do estagio de gravidez, parto prematuro, nascimento de natimorto ou haver septicemia neonatal. Em recém-nascido quando infectado no momento do parto e os sintomas típicos de listerose são de uma meningite. A sintomatologia tem início de uma a quatro semanas após o nascimento, mas existem relatos de período de quatro dias.
Na fase entérica, a sintomatologia é semelhante de uma gripe, acompanhada de diarréia e febre moderada. Mas alguns casos estes sintomas são inaparentes. Pode ocorrer também estado de duração indefinida.
A ocorrência de bacteremia por L. monocytogenes em adultos não é rara. Febre é o sintoma mais comum, mas alguns pacientes queixam-se de fadiga, mal-estar, podendo haver presença de náusea, vômitos dores e diarréia. A mortalidade entre imunodeprimidos, debilitados e recém-nascidos é de 30%.
O comprometimento do SNC a manifestção dá-se através do aparecimento de meningite, encefalite e de abcessos. A meningite é a manifestação mais comum, ocorre principalmente em recém-nascidos e idosos. Seu desenvolvimento clínico é fulminante, com índice de mortalidade de, aproximadamente, 70%. Outras formas localizadas de listerose são a endocardite e osteomielite, mas são formas rara. O perído de incubação da listerose varia de um dia a algumas semanas, sendo dose infecciosa de L. monocytogenes desconhecida.

1.3. Mecanismo de Patogenecidade

A L. monocytogenes entra no organismo do hospedeiro por via oral, atinge o trato intestinal aderindo e invadindo a mucosa. Em seguida, a célula bacteriana é fagocitada por macrófagos. Após a lise da membrana fagocítica, é liberada no citoplasma da célula do hospedeiro, onde se multiplica rapidamente. Ocorre também a polimerização de filamentos de actina da célula do hospedeiro, formando longas caudas em uma das extremidades da célula bacteriana. Esses filamentos causam o deslocamento da bactéria no citoplasma, permitindo a invasão das células adjacentes, dando início a um novo ciclo de infecção.
Os fatores de virulência tentam explicar o mecanismo de patogenicidade de L. monocytogenes. Temos:
-Listeriolisina O (LLO)- é uma hemolisina produzida pela L. monocytogenes, faz parte da família da citolisinas formadas pela ativação de grupamentos sulfidrilas. Tem a função de mediar à lise dos vacúolos que contêm a células bacterianas, uma vez que as células mutantes não produtoras de listeriolisina são geralmente encontrados no interior destes vacúolos sendo, conseqüentemente, incapazes de se multiplicar intracelularmente.
-Fosfolipases: a L. monocytogenes produz outras duas hemolisinas a fosfatidilinositol-fosfolipase C (PI-PLC) e a fosfatidilcolina fosfolipase C (PC-PLC), que hidrolisam os lipídeos da membrana, causando ruptura da célula.
-p60: todas as cepas de L. monocytogenes sintetizam esta proteína, parece estar associada com a capacidade invasiva da bactéria, uma vez que está envolvida com a fagocitose de L. monocytogenes e mutantes rugosos apresentam uma diminuição na capacidade invasora.
-Interleucina: é uma proteína da membrana, provavelmente envolvida no mecanismo de invasão da célula do hospedeiro.

1.4. Epidemiologia

A L. monocytogenes pode ser encontrada disseminada na natureza. No homem é difícil realizar seu isolamento devido à colonização no trato intestinal. Mas já foi isolada uma grande variedade de animais gado bovino, galinhas, cachorros, lebres, peixes, larvas de insetos, dentre outros.
O primeiro suro de listerose ocorreu na década de 80 no Canadá, onde foram encontrados repolhos tipo coleslaw contaminados por L. monocytogenes. Nos EUA em 1983, ocorreu um surto que envolveu 49 indivíduos, com mortalidade de 29%, o alimento responsável foi o leite pasteurizado. Na Suíça, entre 1983 e 1987 ocorre um surto causado por queijo tipo mole, com 122 casos e 31 mortes.
A L. monocytogenes tem sido isolada em alimentos como leite cru e pasteurizado, queijos, carnes bovinas, suínas, de aves, peixes embutidos, carne moída de diferentes animais, produtos cárneos crus e termoprocessados, além de produtos de origem vegetal, de origem marinha e refeições preparadas. Isolamentos realizados em diversos países incluindo o Brasil.
Em relação à sua presença em leite pasteurizado, estudos estão sendo realizados para esclarecer a termotolerância desta bactéria. Existem duas teorias para elucidar esta questão. A primeira delas relaciona-se ao fenômeno da resposta do choque térmico: quando as células de L. monocytogenes são expostas a temperaturas sub-leteias, entre 44-48ºC, antes de serem submetidas à temperatura final de tratamento, elas apresentam um aumento de resistência térmica. A segunda teoria diz respeito à metodologia empregada para recuperação de microrganismos estressados por processamento térmico. O uso de técnicas anaeróbias para a recuperação destas células leva à recuperação de um número maior de células do que quando recuperadas na presença de oxigênio.

1.5. Medidas de controle

Para evitar a contaminação dos alimentos por L. monocytogenes, é necessárias medidas de controle no local de processamento do alimento. Sabendo que esta bactéria está amplamente distribuída e pode se desenvolver em ampla faixa de temperatura e de pH, além de ser uma das células vegetativas de maior resistência térmica, deve-se prevenir sua entrada na indústria de alimentos. Para tanto, deve-se fazer controle do microrganismo nos pontos de origem da matéria-prima através de medidas que minimizem as chances de contaminação.
Medidas que podem ser tomadas no local de produção:

• 
  
  Limpeza e sanificação dos equipamentos;



• 
  
  Construção de indústrias de maneira a impedir a entrada de animais, poeiras e insetos;
  Evitar contato com o produto final com a matéria-prima, evitando, assim a contaminação cruzada;



• 
  
  Apresentação pela indústria de um setor de controle de qualidade que se aplique não somente aos parâmetros de processamento, mas também ao controle do ambiente, inclusive do pessoal.

BIBLIOGRAFIA

• 
  
  FRANCO, Bernadette D. G. de Melo; Microbiologia dos Alimentos. Págs:46, 47 e 48. Atheneu. São Paulo, 2008.



• 
  
  JAY, James M.; Microbiologia de Alimentos. 6ª Edição. Págs 517 a 537. Artmed. Porto Alegre, 2005
  

Acadêmica: Karen Quevedo

CARACTERIZAÇÃO DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR

É muito comum pessoas incriminarem os alimentos que acabaram de consumir como causadores dos distúrbios gastrintestinais que venham apresentar. Considerando o fato que, em condições normais, um indivíduo alimenta-se varias vezes ao dia, qualquer doença ocorre sempre “após a refeição”. Entretanto, antes que determinado alimento possa ser incriminado como o causador de um problema gastrintestinal, varias procedências são necessárias.

De acordo com a Center for Disease Control and Prevention (CDC), dos Estados Unidos, define-se como surto de doença de origem alimentar a ocorrência de dois ou mais casos de doença associada a um único alimento.
A identificação de um surto de doença de origem alimentar é realizada através de um inquérito epidemiológico, conduzido entre indivíduos que tenham q que não tenham consumido o(s) alimento(s) suspeito(s), quer tenham apresentado os sintomas característicos, quer não, e também através de exames laboratoriais em amostras clínicas e nas amostras de alimentos. Deve-se considerar também que nem todos os indivíduos que consomem o mesmo alimento contendo um agente patogênico apresentam a mesma sintomatologia. O período de incubação, a gravidade e a duração da doença podem ser diferentes, em função da idade, do estado nutricional, da sensibilidade individual e da quantidade de alimento ingerido.
Em grande parte dos surtos de doenças microbiana de origem alimentar relatados, a identificação do alimento causador é inferida apenas com base no inquérito epidemiológico. Somente em alguns raros casos reportados, a identificação do microrganismo patogênico no material clínico nas amostras de alimentos foi possível. Isto pode ser explicado por que:
A- o(s) alimentos(s) suspeito(s) não está(ão) mais disponível(is) para análise laboratorial;
B- não é possível caracterizar o alimento suspeito;
C- a análise laboratorial é limitada, pois, devido ao custo, é impraticável investigar todos os patógenos possíveis;
D- as metodologias laboratoriais empregadas para isolamento e identificação dos inúmeros patógenos não são 100% eficientes.

BIBLIOGRAFIA

FRANCO, Barnadette Gombossy; Microbiologia dos Alimentos. Pgs: 34 e 35. Editora: Atheneu. São Paulo, 2008.

Acadêmica: Karen Quevedo

VIROLOGIA

Propriedades gerais dos vírus

Os vírus são os menores agentes infecciosos e contém apenas um tipo de ácido nucléico (RNA e DNA) como genoma, circundado por um envelope protéico que pode ser delimitado por uma membrana contendo lipídio. A unidade infecciosa completa é denominada virion. Os vírus são inertes no ambiente extracelular, replicam-se apenas em células vivas e são parasitos em nível genético. O ácido nucléico viral contém a informação necessária para programar a célula infectada do hospedeiro a sintetizar macromoléculas específicas do vírus necessárias à produção da progênie viral. Durante o ciclo de replicação, são produzidas numerosas cópias de ácido nucléico viral e proteínas do envelope. As proteínas do envelope organizam-se para formar o capsídio, que envolve e estabiliza o ácido nucléico viral, protegendo-o do ambiente extracelular, bem como facilitando a fixação e penetração do vírus ao entrar em contato com novas células suscetíveis. A infecção por vírus pode ter pouco ou nenhum efeito sobre a célula hospedeira, ou resultar em lesão ou morte celular.
O universo dos vírus apresenta grande diversidade. Os vírus variam enormemente na sua estrutura, organização e expressão do genoma, bem como as estratégias de replicação e transmissão. A variedade do hospedeiro para determinado vírus pode ser ampla ou extremamente limitada. Sabe-se eu os vírus infectam os microrganismos unicelulares, como micoplasmas, bactérias e algas, bem como todas as plantas e animais superiores.
Grande parte da informação sobre as relações entre vírus e hospedeiro foi obtida de estudos com bacteriófagos, isto é, vírus que atacam bactérias.

Origem Evolutiva dos vírus

Desconhece-se a origem dos vírus. Existem profundas diferenças entre os vírus de DNA, os de RNA e os que utilizam tanto o DNA quanto o RNA com material genético durante diferentes estágios de seu ciclo de vida. É possível que os diferentes tipos de agente tenham origens distintas. Duas teorias sobre a origem dos vírus podem ser resumidas da seguinte maneira:
(1) Os vírus podem ser derivados do DNA ou do RNA dos ácidos nucléicos de células hospedeiras que adquiriram a capacidade de replicação autônoma e evoluíram independentemente. Assemelham-se a genes adquiriram a capacidade de existir independentemente da célula. Algumas sequências virais estão relacionadas com porções de genes celulares que codificam domínios funcionais protéicos. É provável que pelo menos alguns vírus tenham evoluído dessa maneira.
(2) Os vírus podem constituir em formas degeneradas de parasitos intracelulares. Não há evidências de que os vírus tenham evoluído a partir de bactérias, embora exista probabilidade de que outros microrganismos intracelulares obrigatórios – como, por exemplo, riquétsias e clamídias - tenham deito isso. Todavia, os poxvírus são tão grandes e complexos que podem representar produtos evolutivos de algum ancestral celular.

Classificação dos vírus

Foram utilizadas as seguintes propriedades como base para a classificação dos vírus. A quantidade de informações disponíveis em cada categoria não é a mesma para todos os vírus. Os métodos empregados para caracterizar os vírus mudam rapidamente. Hoje, a determinação da sequência do genoma é frequentemente efetuada na identificação inicial do vírus, e as comparações com base de dados disponíveis evitam a necessidade de obter maior número de dados clássicos (por exemplo, densidade de flutuação do virion). Os dados relativos à sequência genômica constituem critérios taxonômicos avançados (por exemplo, ordem dos genes) e podem fornecer a base para a identificação de novas famílias de vírus.
(1) Morfologia do virion, incluindo o tamanho, a forma, o tipo de simetria, a presença ou ausência de peplômeros e presença ou ausência de membranas.
(2) Propriedades do genoma do vírus, incluindo tipo de ácido nucléico (DNA e RNA), tamanho do genoma em quilobases (Kb) ou pares de quilobases (kbp), número de fitas (simples ou duplo), linear ou circular, sentindo/ polaridade (positivo, negativo, com ambos os sentidos), segmentos (número e tamanho), sequência de nucleotídios, conteúdo de G + C, presença de características especiais.
(3) Propriedades físico-químicas do virion, incluindo a massa molecular, densidade de flutuação, estabilidade em pH, termoestabilidade e suscetibilidade e agentes físicos e químicos particularmente éter e detergentes.
(4) Propriedades das proteínas virais, incluindo o número, o tamanho e as atividades funcionais das proteínas estruturais e não estruturais, sequência de aminoácidos, modificações (glicosilação, fosforilação, miristilação) e atividades funcionais especiais (transcriptase reversa, neuraminidase, atividades de fusão).
(5) Organização e replicação do genoma, incluindo a ordem dos genes, número e posição das estruturas de leitura abertas, estratégia de replicação (padrões de transcrição, tradução) e locais celulares (acúmulo de proteínas, organização do virion, liberação do virion).
(6) Propriedades antigênicas.
(7) Propriedades biológicas, incluindo variedade de hospedeiros naturais, modo de transmissão, relação com vetores, patogenicidade, tropismos teciduais e patologia.

Modos de transmissão dos vírus

Os vírus podem ser transmitidos das seguintes maneiras:

• Transmissão direta de uma pessoa para outra por contato; os principais meios de transmissão podem incluir os perdigotos ou aerossóis (influenza, sarampo, varíola); por via orofecal (enterovírus, rotavírus, hepatite A), por contato sexual (Hepatite B, herpes simples tipo 2, HIV), por contato mão-boca, mão-olhos ou boca-boca (herpes simples, rinovírus, vírus de Epstein-Barr), ou por sangue contaminado (Hepatite B, HIV);
  
• Transmissão de um animal para outro, sendo o ser humano um hospedeiro acidental. A transmissão pode ocorrer através de mordida (raiva) ou perdigotos ou aerossóis de locais contaminados por roedores (arenavírus, antavírus);
  
• Transmissão por um vetor artrópode (arbovírus, flavivírus e bunyavírus).

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 367, 368 e 390. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: Karen Quevedo

COLORAÇÃO

Os corantes combinam-se quimicamente com protoplasma bacteriano; se a célula ainda não estiver morta, o próprio processo de coloração irá destruí-la. Por conseguinte, trata-se de um processo drástico, possível de produzir artefatos.
Os corantes comumente utilizados são os sais. Os corantes básicos consistem em um cátion dotado de cor com ânion incolor (por exemplo: azul de metileno + /cloreto -); os corantes ácidos comportam-se de modo inverso (por exemplo: sódio + eosinato-). As células bacterianas são ricas em ácido nucléico, apresentando cargas negativas na forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes básicos de carga positiva. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas e, por conseguinte, podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor.
Os corantes básicos coram uniformemente as células bacterianas, a não ser que o RNA citoplasmático seja inicialmente destruído. Entretanto, podem-se utilizar técnicas especiais de coloração para diferenciar os flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, grânulos, nucleóides e esporos.

A coloração pelo GRAM

Uma importante característica taxonômica das bactérias consiste na sua reposta à coloração pelo método de GRAM. A propriedade da coloração pelo GRAM parece fundamental, visto que a reação está correlacionada com muitas outras propriedades morfológicas em formas filogeneticamente correlatas. Um microrganismo potencialmente Gram-positivo pode aparecer dessa maneira apenas em determinado conjunto de condições ambientais e em uma cultura jovem.
A coloração de GRAM começa com a aplicação de um corante básico, o cristal violeta. A seguir, aplica-se uma solução de iodo; todas as bactérias coram-se em azul nessa etapa do processo. A seguir, as células são tratadas com álcool. As células Gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, permanecendo azuis; as células Gram-negativas são totalmente descoradas pelo álcool. Como etapa final, aplica-se um contra corante (como o corante vermelho safranina), de modo que as células Gram-negativas descoradas adquirem uma cor contrastante; nessa etapa, as células Gram-positivas exibem uma cor púrpura. A base da reação diferencial de GRAM é a estrutura da parede celular.

Coloração álcool-ácido-resistente

As bactérias álcool-ácido-resistente são as que retêm carbolfucsina (fucsina básica dissolvida em uma mistura de fenol-álcool-água), mesmo quando descoradas com ácido clorídrico em álcool. Um esfregaço de células em lâmina é banhado com carbolfucsinaa e aquecido em vapor. Após esta etapa, procede-se à descoloração com ácido-álcool e por fim aplica-se um contracorante contrastante (azul ou verde). As bactérias álcool-ácido-resistente (micobactérias) e alguns dos actinomicetos relacionados adquirem cor vermelha, enquanto as outras apresentam a cor do contracorante.

Coloração negativa

É um procedimento que envolve a coloração do material de fundo com um corante ácido, deixando as células incolores. O corante negro nigrosina é comumente utilizado. Esse método é empregado para as células ou estruturas difíceis de serem coradas diretamente.

Coloração dos Flagelos

Os flagelos são demasiado finos para serem visíveis ao microscópio óptico. Entretanto, sua presença e distribuição podem ser demonstradas ao tratar as células com uma suspensão coloidal instável de sais de ácido tânico, provocando a formação de um precipitado maciço sobre as paredes celulares e os flagelos. Dessa maneira, o diâmetro aparente dos flagelos aumenta, de modo que a coloração subsequente com fucsina básica irá torná-los visíveis ai microscópio óptico.
Nas bactérias peritríquias, os flagelos formam feixes durante o movimento, podendo ser espessos o suficiente para serem observadas em células vivas à microscopia de campo escuro ou de contraste de fase.

Coloração da cápsula

Em geral, as cápsulas são evidenciadas pelo processo de coloração negativa ou por modificações dela. Um desses “corantes de cápsula” (método de Welch) envolve o tratamento com solução a quente de cristal violeta, seguido de lavagem com solução de sulfato de cobre, utilizada para remover o excesso do corante, pois a lavagem convencional com água dissolveria a cápsula. O sal de cobre também cora o fundo, resultando em uma célula e fundo de cor azul- escura, enquanto a cápsula aparece em azul bem mais claro.

Coloração dos nucleóides

Os nucleóides podem ser corados pelo corante de Feulgen, específicos do DNA.

Coloração dos esporos

Os esporos são observados mais simplesmente na forma de corpúsculos intracelulares refrateis em suspensões de células não coradas ou como áreas incolores em células coradas por métodos convencionais. A parede do esporo é relativamente impermeável, porém os corantes podem atravessá-la mediante o aquecimento da preparação. A seguir, a mesma impermeabilidade serve para evitar a descoloração do esporo pelo tratamento com álcool, suficiente para descorar as células vegetativas, que podem ser finalmente contracoradas. Comumente, os esporos são corados com verde de malaquita ou carbolfucsina.

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 40,41. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: Karen Quevedo

FATORES ANTIMICROBIANOS NATURAIS

A estabilidade de alguns alimentos frente ao ataque de microrganismos é devida à presença de algumas substâncias naturalmente presentes nesses alimentos, tendo a capacidade de retardar ou mesmo impedir a multiplicação microbiana.

Os condimentos são um bom exemplo, pois contêm vários óleos essenciais com atividade antimicrobiana, tais como eugenol no cravo, alicina no alho, aldeído cinâmico e eugenol na canela alil-isotiocianato na mostarda, timol e isotimol no orégano.

O ovo, em especial a clara, tem diversos agentes antimicrobianos naturais. Além de apresentar pH desfavorável à multiplicação microbiana (entre 9 e 10), a clara do ovo é rica em lisozima, enzima capaz de destruir a parede celular bacteriana, sendo especialmente ativa em bactérias Gram-positivas. Além desses, agem também a avidina, a conalbumina e outros inibidores enzimáticos.

O leite proveniente de gado bovino também contém numerosas substâncias antimicrobianas naturais, que podem agir específica ou inespecificamente. Entre os compostos de ação específica estão às imunoglobulinas, o fator complemento, os macrófagos e os linfócitos. Uma grande série de fatores inespecíficos antimicrobianos em leite já foi descrita, sendo o mais importante o sistema lactoperoxidase (SLP). Esse sistema age através da quebra de peróxidos (água oxigenada, por exemplo) presentes no leite, liberando oxigênio que promove a oxidação de grupos SH de enzimas metabólicas vitais para o microrganismo. Esse sistema depende ainda da presença de tiocianato ou outro substrato oxidável. O SLP é bactericida para bactérias Gram-negativas e bacteriostático para as Gram-positivas.

A lactoferrina do leite tem também atividade antimicrobiana. Trata-se de uma proteína que inibe a multiplicação através da retirada de íons ferro d leite. Outras substâncias como a lisozima, naturalmente presente no leite, e a nisina, produzida por bactérias láticas no leite, também são importantes no controle do desenvolvimento microbiano.

Os derivados do ácido hidroxicinâmico, encontrados em frutas e vegetais, são importantes agentes antimicrobianos, com ação predominantemente sobre bactérias e alguns fungos, assim como os taninos, presentes em frutas e sementes. As frutas contêm ácidos orgânicos e óleos essenciais importantes na inibição da multiplicação microbiana.

Entre os fatores antimicrobianos naturais devem ser incluídas as estruturas biológicas que funcionam como barreiras mecânicas para a penetração de microrganismos. Nessa categoria estão a casca das nozes, das frutas e dos ovos, a pele dos animais e a película que envolve as sementes.

Além dos fatores antimicrobianos naturalmente presentes nos alimentos, tem importante papel os compostos químicos propositalmente adicionados aos alimentos (conservados) como recurso tecnológicos para estender sua vida util.

BIBLIOGRAFIA

FRANCO, Bernadette Dora Gombossy de Melo [et al]; Microbiologia dos Alimentos. Pgs: 20,21. 1ª Edição. Atheneu. São Paulo, 2008.

Acadêmica: Karen Quevedo

MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS SEM O USO DE CULTURAS

As tentativas de estimar o número total de bactérias, arqueobactérias e vírus são frustrantes devido a dificuldades, tais como a detecção e recuperação do meio ambiente, ou o conhecimento incompleto de associações microbianas obrigatórias e o problema do conceito de espécie nestes grupos. Contudo, estimativas sugerem que o número de microrganismos não-cultiváveis excede grandemente o de organismos cultiváveis. Até recentemente, a identificação microbiana exigia o isolamento de culturas puras (ou, em alguns casos, de co-culturas definidas), seguido de testes para múltiplas características fisiológicas e bioquímicas. Os médicos já estão familiarizados com as doenças humanas associadas a microrganismos visíveis, porém não-cultiváveis. Na atualidade, os cientistas estão utilizando uma abordagem auxiliada pela PCR, utilizando o RNAr para a identificação de microrganismos patogênicos in situ.
A primeira fase dessa abordagem envolve a extração do DNA de uma amostra apropriada, o uso de técnicas moleculares padronizadas para obter uma biblioteca de clones, a recuperação da informação de sequências do DNAr e a análise comparativa das sequências recuperadas. Todos esses dados fornecem informações sobre a identidade ou relação das sequências em comparação com a base de dados disponíveis. Na segunda fase, a prova de que as sequências provêm de células da amostra original é obtida por hibridização in situ, utilizando sondas específicas para sequências.
Essa abordagem vem sendo utilizada na identificação de microrganismos patogênicos. Por exemplo, um actinomiceto previamente não-caracterizado foi identificado como a bactéria em forma de bastonete associado à doença de Whipple, para a qual foi proposto o nome de Tropheryma whipplei. A abordagem com o RNAr também foi utilizada para identificar o agente etiológico da angiomatose bacilar como Bartonella henselae e mostrar que o patógeno oportunista, Pneumocystis jiroveci, é um fungo.

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 49 e 50. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: Karen Quevedo

MÉTODOS ÓPTICOS

1. MICROSCÓPIO DE CAMPO LUMINOSO (MICROSCÓPIO ÓPTICO COMUM)
O microscópio de campo luminoso é mais o empregado em microbiologia de rotina, constituindo em duas séries de lentes (objetiva e ocular), que funcionam em conjunto na resolução de imagens. Estes microscópios geralmente empregam uma objetiva com o poder de aumento de 100 vezes, com uma ocular de aumento de 10 vezes, aumentando a amostra 1.00 vezes. Por conseguinte, as partículas com 0,2 μm de diâmetro são ampliadas até cerca de 0,2 mm, tornando-se nitidamente visíveis. A ampliação adicional não proporciona maior resolução doa detalhe, reduzindo a área visível (campo).
Com este microscópio, as amostras são visualizadas devido à diferença de contraste entre elas e o meio ao redor. Muitas bactérias são difíceis de visualizar devido à perda de contraste com o meio. Corantes podem ser usados para corara células ou organelas e aumentar seu contraste de modo a tornar mais fácil a visualização em microscopia de campo luminoso.

2. MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE
O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para aumentar as diferenças de contraste entre células e o meio ao redor, possibilitando ver células vivas sem corá-las; com microscópio de campo luminoso, preparações que coram e matam a célula precisam ser empregadas.
O microscópio de contraste de fase tem como vantagem o fato de que as ondas de luz passam através de objetos transparentes, tais como as células, aparecendo em diferentes fases, dependendo das propriedades dos materiais através dos quais elas passam. Este efeito é ampliado por um anel especial de lentes da objetivas do microscópio de contraste de fase, o que leva à formação de imagem escura em forma de luz de fundo.

3. MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO
O microscópio de campo escuro é um microscópio óptico no qual o sistema de iluminação foi modificado para atingir somente os lados da amostra, o que é obtido pelo uso de um condensador especial que bloqueia tanto os raios da luz direta quanto a luz refletida para o exterior através de um espelho posicionado ao lado do condensador em ângulo oblíquo, criando um “campo escuro” que contrasta contra a borda sombreada das amostras, surgindo quando os raios oblíquos são refletidos a partir das bordas da amostra em direção ascendente à objetiva do microscópio. A resolução obtida por um microscópio de campo escuro é bastante elevada. Assim, essa técnica foi particularmente valiosa na observação de certos organismos, como o Treponema pallidum, um espiroqueta com menos de 0,2 μm de diâmetro e que não pode ser observado em microscópio óptico convencional ou de contraste de fase.

4. MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
O Microscópio de fluorescência é utilizado para visualizar amostras que fluorescem, que é a habilidade de absorver a luz em comprimentos de ondas curtos (ultravioleta) e não brilhar em comprimentos de onda mais longos (luz visível). Alguns organismos fluorescem naturalmente devido à presença de substancias fluorescentes, chamadas de fluorocromos. O microscópio de fluorescência é amplamente utilizado em diagnósticos de microbiologia clínica. Por exemplo, o fluorocromo auramina O, que dá um brilho amarelo quando exposto à luz ultravioleta.
O principal uso da microscopia de fluorescência é na técnica de diagnóstico chamada de imunofluorescência. Nessa técnica, anticorpos específicos (por exemplo: anticorpos contra a Legionella pneumophila) são marcados quimicamente com fluorocromo, como o isotiocianato de fluoresceína. Em seguida, tais anticorpos fluorescentes são adicionados a uma lâmina de microscópio que contém a amostra clínica. Se amostra contém algum L. pneumophila, o anticorpo fluorescente se liga aos antígenos de superfície da bactéria, produzindo fluorescência quando exposto à luz ultravioleta.

5. MICROSCÓPIO DE INTERFERÊNCIA DIFERENCIAL DE CONTRASTE (DIC)
Os microscópios de interferência diferencial de contraste utilizam um polarizador para produzir luz polarizada. Os feixes de luz polarizada passam através de um prisma que vai gerar dois tipos distintos de feixes simples. Devido às ligeiras diferenças do índice de refração das substâncias para cada feixe que passa por elas, os feixes combinados não ficam totalmente na mesma fase; em vez disso, criam um efeito de interferência que intensifica as sutis diferenças na estrutura celular. Estruturas, como esporos, vacúolos e grânulos, aparecem em forma tridimensional. A microscopia da DIC é particularmente útil para a observação das células não coradas devido à sua habilidade de gerar imagens que revelam estruturas celulares internas, menos aparentes pelas técnicas de microscopia óptica.

6. MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
O alto poder de resolução do microscópio eletrônico permitiu aos cientistas a visualização e o detalhamento de estruturas das células procarióticas e eucarióticas. A resolução superior do microscópio eletrônico deve-se ao fato de elétrons terem um comprimento de onda muito mais curto que os fótons de luz branca.
Existem dois tipos de microscópio eletrônico em uso feral: microscópio eletrônico de transmissão (MET) que tem muitas características em comum com o microscópio óptico, e o microscópio eletrônico de varredura (MEV), o primeiro a ser desenvolvido, e que empregada um feixe de elétrons emitido de um canhão e direcionado ou focalizado por um condensador eletromagnético sobre uma amostra delgada. À medida que os elétrons incidem na amostra, são dispersos diferencialmente de acordo com o número e a massa de átomos na amostra; alguns elétrons atravessam a amostra, sendo reunidos e focalizados por uma lente objetiva eletromagnética que fornece uma imagem da amostra a sistema de lentes protetoras para maior ampliação. A imagem é visualizada ao incidir em uma tela que fluoresce com a incidência dos elétrons; pode ser registrada em filme fotográfico. O MET tem uma capacidade de resolução de 0,001 μm para partículas distantes. Os vírus, com diâmetro de 0,01 a 0,2 μm, podem sem facilmente observados.
Em geral, o MEV tem menor poder de resolução do que o MER, mas particularmente útil ao fornecer imagens tridimensionais da superfície dos materiais microscópicos. Os elétrons são focados através de lentes em um ponto muito fino. A interação dos elétrons com a amostra resulta na liberação de diferentes formas de radiação da superfície do material, que podem ser capturadas por um detector apropriado, ampliadas e, a seguir, apresentadas na forma de imagem em microscopia na tela de uma televisão.

7. MICROSCÓPIO DE VARREDURA CONFOCAL A LASER
O microscópio de varredura confocal a laser (MVCL) acopla uma fonte de raio laser à luz do microscópio. Na microscopia de varredura confocal a laser, um feixe de laser é espalhado contra um espelho que o direciona através de um orifício que ajusta precisamente o plano de foco do feixe a uma camada vertical no interior da amostra. Pela iluminação precisa de um único plano da amostra, a intensidade de iluminação cai rapidamente acima e abaixo do plano de foco, e a luz se perde para outros planos de focos, minimizados. Assim, em uma amostra relativamente espessa, varias camadas podem ser observadas ajustando o plano de foco da luz a laser.
Certas células são frequentemente coradas com corantes fluorescentes para torná-las mais visíveis. Alternativamente, imagens com falsas cores podem ser geradas pelo ajuste do microscópio de modo a fazer com que diferentes camadas apresentam diferentes colorações. Os MVCL são equipados com um programa de computador para juntar imagens digitais e processá-las posteriormente. Assim, as imagens obtidas da diferentes camadas podem ser armazenadas e superpostas digitalmente para reconstruir uma imagem tridimensional da amostra inteira.

BIBLIOGRAFIA

BROOKS, Geo F. [et.al]; Microbiologia médica. 24ª Edição. Págs 8,9 e 10. Editora Mc Graw Hill. Rio de Janeiro,2009.

Acadêmica: KAREN QUEVEDO

Doenças provocadas por Clostridium

O gênero Clostridium possui varias características como a sensibilidade ao oxigênio, serem Gram positivos, presença de endoesporos, incapacidade de reduzir sulfato a sulfito; porém nem todas as bactérias presentes nessa classificação têm essas características.
Foram usados para a classificação desse gênero métodos embasados em exames de diagnósticos como a demonstração de esporos, o crescimento ideal em condições anaeróbicas, um padrão complexo de reatividades bioquímicas e a detecção de ácidos graxos voláteis característicos por cromatografia gasosa. Assim foram diferenciados 177 tipos de espécies bacterianas, contudo a maior parte das bactérias que puderam ser isoladas não tem importância clínica e, as que interessam, são poucas.
Mas foram feitas novas pesquisas e com o uso de técnicas que seqüenciaram o genoma dessas bactérias foram feitos novas divisão que, de maneira apropriada, deveriam ter sido divididas em novos gêneros, entretanto a classificação ainda está por isso ainda usamos o nome Clostridium.
Nesse trabalho abordaremos dois microrganismos em especial, Clostridium tetani e Clostridium botulinum, que tem significado clínico grave. Esses patógenos quando infectam o corpo humano produzem toxinas que afetam o sistema nervoso e impedem a liberação de neurotransmissores, por conseqüência ocorrem sérios danos a esse sistema.

1. TÉTANO

O tétano é uma doença grave causada pela toxina produzida por uma bactéria, o Clostridium tetani. Essa bactéria é encontrada no ambiente (solo, esterco, superfície de objetos) sob uma forma extremamente resistente, o esporo. Quando contamina lesões, sob condições favoráveis (presença de tecidos mortos, corpos estranhos e sujeira), torna-se capaz de produzir a toxina, que atua em terminais nervosos, induzindo fortes contrações musculares.

1.1 Clostridium tetani

1.1.1 Fisiologia e estrutura

C. tetani é um bastonete GRAM-POSITIVO anaeróbio, móvel e esporulado. É difícil de cultivar, porque este organismo é extremamente sensível a toxidade do oxigênio e, quando o crescimento é detectado em meio de ágar, tipicamente se apresenta como uma película sobre a superfície do ágar em vez de colônias discretas. As bactérias são proteolíticas, mas incapazes de fermentar carboidratos.

1.1.2 Patogênese

Embora as células vegetativas de C. tetani morram rapidamente em contato com o oxigênio, a formação de esporos permite que o organismo sobreviva nas condições mais adversas. Ainda mais importante é o fato e que o C. tetani produz duas toxinas, uma hemolisina sensível ao oxigênio (tetanolisina) e uma neurotoxina termolábil, codificada por plasmídeo (tetanospasmina) que transporta o gene da tetanospasmina é não conjugativo, portanto uma cepa atóxica de C. tetani não pode se converter em uma cepa toxigênica.
A tetanospasmina é produzida durante a fase estacionária de crescimento e é liberada na lise celular, sendo responsável pelas manifestações clinicas do tétano. A toxina peptídica é “cortada” por enzimas proteolíticas para formar duas cadeias peptídicas unidas por pontes dissulfeto. Em condições reduzidas, os dois peptídeos são cindidos em cadeia leve (α) e uma cadeia pesada (β). A cadeia α é internalizada e se move dos nervos periféricos para o sistema nervoso central (SNC), ela atua bloqueando a inibição pré-sináptica do SNC, causando paralisia espasmódica, tétanos e convulsões generalizadas. Quando alcança o SNC se fixa ao seu receptor a toxina bloqueia a inibição pós-sináptica normal do neurônio espinhal que segue impulsos aferentes, impedindo a liberação dos inibidores neurotransmissores. A sensibilidade resultante dos impulsos excitadores, não controlados por mecanismos de inibidores, produz uma paralisia espasmódica generalizada, característica do tétano.

1.2. Epidemiologia

C. tetani é ubiquitário. É encontrado no solo fértil e coloniza transitoriamente o trato gastrointestinal de muitos animais, incluindo humanos. As formas vegetativas de C. tetani são extremamente suscetíveis à toxidade pelo oxigênio, mas os organismos formam esporos rapidamente, podendo sobreviver na natureza por longos períodos. Nos EUA a doenças é relativamente rara, manos de 40 casos por ano sendo os idosos com diminuição da imunidade os afetados. Porém, em países em desenvolvimento ainda é um grande causador de vitimas, devido não terem em disposição a vacinação. Estima-se que ocorra 1 milhão de casos por ano, com mortalidade de 30% a 50%, sendo que metade em neonatos.

1.3. Doenças clínicas

O período de incubação do tétano varia de alguns dias até semanas. A duração de incubação está diretamente relacionada à distância da infecção primária em relação ao sistema nervoso central (SNC).
Tétano localizado: o início dos sintomas ocorre com mialgia por contrações involuntárias dos grupos musculares próximos ao ferimento, podendo ficar restrito a um determinado membro.
Tétano cefálico: ocorre devido a ferimentos em couro cabeludo, face, cavidade oral e orelha, levando a paralisia facial ipsilateral à lesão, trismo, disfagia e comprometimento dos pares cranianos iii, iv, ix, x, xii.
Tétano generalizado: caracterizado pelo trismo, devido à contração dos masseteres e músculos da mímica facial, ocasionando o riso sardônico. Outros grupos musculares são acometidos, como os retos abdominais e a musculatura paravertebral, podendo ocasionar opistótono (característico das crianças). Com a evolução da doença, os demais músculos do organismo são acometidos progressivamente. As contraturas musculares vêm logo a seguir e, dependendo de sua intensidade e freqüência, o tétano poderá ser com menor ou maior gravidade, piorando aos estímulos auditivos, visuais e táteis. Dependendo de sua intensidade, esses espasmos podem evoluir até para fraturas de vértebras ou parada respiratória. O paciente tetânico, a despeito de sua gravidade, permanece sempre lúcido. A febre, quando presente, indica mal prognóstico ou infecção secundária. Entre as manifestações de hiperatividade simpática, temos: taquicardia, hipertensão arterial lábil, sudorese profusa, vasoconstrição periférica, arritmias cardíacas e até hipotensão arterial.
Tétano neonatal: é causado pela aplicação de substâncias contaminadas na ferida do coto umbilical. O período de incubação é de aproximadamente sete dias e tem como característica principal o opistótono. No início, a criança pode apresentar apenas dificuldade para se alimentar. Geralmente ocorre em filhos de mães não-vacinadas ou inadequadamente vacinadas no pré-natal. É importante o diagnóstico diferencial com meningite e sepse do período neonatal, já que os quadros infecciosos graves neste período podem cursar com opistótono.

1.4. Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico do tétano, como o da maioria de doenças por clostrídios, é feito com base na apresentação clínica. A detecção microscópica de C. tetani ou seu isolamento em cultura são úteis, mas frequentemente falham. Os resultados da cultura são positivos em apenas cerca de 30% dos pacientes com tétano, porque a doença pode ser causada por relativamente poucos organismos, e as bactérias de crescimento lento são rapidamente destruídas quando expostas ao ar. A toxina tetânica e os anticorpos contra ela não são detectáveis no paciente, porque a toxina se liga e é internalizada rapidamente por neurônios motores. Se o organismo for isolado em cultura, a produção de toxina pelo isolado pode ser confirmado pelo teste de neutralização com antitoxina tetânica em ratos (realizado apenas em laboratórios de referência em saúde pública).

1.5. Tratamento, prevenção e controle

A mortalidade associada ao tétano tem diminuído persistente durante o último século. A mortalidade ocorre entre neonatos e pacientes cujo período de incubação seja menor que uma semana.
O tratamento do tétano requer o debridamento da ferida primária (que pode parecer inócua), o uso de metronidazol, a imunização passiva com imunoglobulina titânica humana e a vacinação com toxóide tetânico. O cuidado com a ferida e a terapia com metronidazol eliminam as bactérias vegetativas que produzem a toxina, e os anticorpos antitoxina agem ligando a moléculas livres de tetanospasmina. Metronidazol e penicilina apresentam atividades equivalentes contra C. tetani; entretanto, a penicilina, assim como a tetanospasmina, inibe a atividade de GABA, portanto não deve ser utilizada. A toxina ligada a terminações nervosas está protegida de anticorpos. Assim, os efeitos tóxicos devem ser controlados sintomaticamente até que a regulação normal da transmissão sináptica seja restaurada.
A vacinação, feita em uma série de três doses de toxóide tetânico, seguida por doses de reforço a cada 10 anos, é altamente eficiente na prevenção do tétano.

Fotos:

Tétano neonatal

2. BOTULISMO

Forma de intoxicação alimentar, causada por uma toxina produzida pela bactéria Clostridium botulinum, presente no solo e crescem em alimentos contaminados (frutas, vegetais conservados de modo inadequado), condimentos e produtos derivados de pescados. A intoxicação se caracteriza por um comprometimento severo do sistema nervoso, podendo levar a morte.

2.1 Clostridium botulinum

2.1.1. Fisiologia e Estrutura

C. botulinum, o agente etiológico do botulismo, é um grupo heterogêneo de grandes bastonetes, anaeróbios fastidiosos e esporulados. Estas bactérias se subdividem em quatro grupos, com base em propriedades fenotípicas e genéticas, e certamente representam quatro espécies separadas que foi classificada historicamente como uma espécie única. Sete toxinas botulínicas antigenicamente distintas (A a G) foram descritas; a doença humana está associada aos tipos A, B, E e F. A p0rodução de toxinas está associada a grupos específicos.

2.1.2. Patogênese

Assim como a toxina tetânica, a toxina de C. botulinum é uma protoxina (toxina A-B) de 150.000 Da que consiste em uma subunidade pequena (cadeia leve ou A) com atividade de endopeptidase de zinco e uma subunidade grande (cadeia pesada ou B), atóxica. Ao contrário da neurotoxina tetÂnica, a toxina de C. botulinum forma complexos com proteínas atóxicas que protegem a neurotoxina durante a passagem pelo trato digestivo (o que é desnecessário para a neurotoxina tetânica). A porção carboxiterminal da cadeia pesada botulínica se liga a glicoproteínas e receptores de ácido siálico específicos (diferentes daqueles da tetanospasmina) na superficie de neurônios motores e estimula a endocitose da molécula de toxina. A neurotoxina botulinica permanece na junção neuromuscular. A acidificação do endossomo estimula a liberação N- terminal da cadeia leve, mediada pela cadeia pesada. A endopeptidase botulínica inativa, então, as proteínas que regulam a liberação de acetilcolina, bloqueando a neurotransmissão em sinapses colinérgicas periféricas. Como a acetilcolina é necessária para a excitação muscular, o quadro clínico resultante do botulismo consiste em uma paralisia flácida. Assim como no tétano, a recuperação da função após o botulismo requer a regeneração das terminações nervosas.

2.2. EPIDEMIOLOGIA

C. botulinum é comumente isolado em amostras de solo e água em todo o mundo o mundo. Nos EUA é encontrado em solo neutro ou alcalino cepas do Tipo A, cepas do Tipo B são encontrados em solo orgânico, cepas do Tipo E são encontradas em solo úmido. Embora seja facilmente encontrado nos EUA a doença é rara.
Foram identificados as seguintes formas de botulismo: (1)botulismo clássico ou alimentar, (2) botulismo infantil, (3) botulismo de ferida e (4) botulismo inalatório.
Os casos de botulismo alimentar está associado a contaminação por alimentos enlatados, sendo que os alimentos podem apresentar aparencia normal, mas mesmo pequena a porção pode provocar a doença clínica fulminante. O botulismo infantil está associado ao consumo de alimentos (particularmente o mel) contaminados com esporos botulínicos. A incidência de botulismo de lesão é desconhecida ou rara. O botulismo inalatório constitui um grande preocupação nesta era de bioterrorismo. A toxina botulínica foi concentrada com o propósito de ser aerossolizada e usada como asma biológica. Quando administrada desta forma, a doença inalatória apresenta um início rápido e potencialmente uma alta mortalidade.

2.3 Doenças clínicas


2.3.1 Botulismo Alimentar:

Pacientes com botulismo alimentar apresentam, tipicamente, fraqueza e tonteiras entre 1 e 2 dias após o consumo do alimento contaminado. Os sinais inciais incluem visão borrada com pupilas fixas e dilatadas, boca seca (indicativa dos efeitos anticolinérgicos da toxina), constipação e dor abdominal. Não ocorre febre. Pacientes com doença progressiva desenvolvem fraqueza descendente bilateral dos músculos periféricos (paralisia flácida), e a morte é mais habitualmente causada por paralisia respiratória. Os pacientes não apresentam alterações sensitivas ao longo da doença. Apesar da conduta agressiva tomada contra a condição do paciente, a doença pode continuar a progredir, porque a neurotoxina se liga irreversivelmente e inibe a liberação exitatória de neurotranmissores por um período prolongado. A recuperação completa frequentemente leva muitos meses ou anos, ou até que as terminações nervosas se regenerem.

A mortalidade em pacientes com botulismo alimentar, que já chegou a 70%, foi reduzida a 10% através do uso de melhores cuidados de suporte, particularmente no tratamento das compicações respiratórias.

2.3.2 Botulismo Infantil:

O botulismo infantil foi inicialmente reconhecido em 1976, e é atualmente a orma mais comum de botulismo nos EUA. Ao contrário do botulismo alimentar, esta doença é causada por neurotoxinas produzidas in vivo por C.botulinum não é capaz de sobreviver e proliferar em seus intestinos. Na ausência de microrganismos entéricos competitivos, entretanto, o organismo pode se estabelecer no trato gastrointestinal de crianças. A doença afeta tipicamente crinaças com menos de 1 ano de idade (a maioria entre 1 e 6 meses), e os sintomas são incialmente inespecíficos (por exemplo: constipação, choro fraco, comprometimento no desenvolvimento).

Pode se desenvolver uma doença progressiva com paralisia flácida e parada respirátoria; entretanto, a mortalidade em casos documentados de botulismo infantil é mutio baixa (1% a 2%). Algumas mortes de neonatos atribuídas a outras condições (por exemplo: síndrome da morte súbita infantil) podem na verdade, ser causada por botulismo.

2.3.3 Botulismo de Lesão:

O botulismo de lesão se desnvolve a partir da produção de toxinas por C. botulinum em lesões contaminadas. Embora os sintomas sejam idênticos aos da doença alimentar, o período de incubação é geralmente mais longo (quatro dias ou mais), e os sintomas gastrointestinais são menos proeminentes

2.4 Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico clínico de botulismo é confirmado se o organismo for isolado ou se for demonstrada a atividade da toxina. Esta é mais facilmente é mais facilmente encontrada nos estágios iniciais da doença. Deve-se realizar uma tentativa de cultivar C. botulinum a partir das fezes de pacientes com doença alimentar e, se possível, do alimento relacionado. Nenhum exame isolado para a detecção de botulismo alimentar apresenta sensibilidade maior que 60%. Por outro lado, a toxina é detectada no soro de mais de 90% dos neonatos com botulismo.
O isolamento de C. botulinum a partir de amostras contaminadas por outros organismos pode ser melhorado pelo aquecimento da amostra a 80ºC durante 10 minutos, para destruir todas as bactérias que não são clostrídios. A cultura da amostra aquecida em meios anaeróbios enriquecidos nutricionalmente permite que os esporos de C. botulinum, que são resistentes ao calor, germinem. As cepas de C. botulinum associadas ao botulismo humano são caracterizadas pela produção de lípase (que aparece como um filme iridescente em colônias cultivadas em ágar gema de ovo) e pela capacidade de digerir proteínas do leite, hidrolisar gelatina e fermentar glicose.
A demonstração da toxina (tipicamente realizada e laboratórios de saúde pública) deve ser realizada com um bioensaio em camundongos. Este procedimento consiste em preparar duas alíquotas do isolado, misturar uma delas com antitoxina e inocular intraperitonelamente cada alíquota em camundongos, confirma-se a atividade da toxina. Amostra do alimento relacionando a doença, fezes e soro do paciente devem sem testadas quando à atividade da toxina.
O diagnóstico de botulismo infantil é corroborado se (1) C. botulinum for isolado nas fezes ou (2) for detectada atividade da toxina nas fezes ou no soro. O organismo pode ser isolado em cultura de fezes em praticamente todos os pacientes, porque os neonatos podem permanecer como portadores assintomáticos do organismo durante muitos meses, mesmo depois de recuperados da doença. O botulismo de lesão é confirmado pelo isolamento do organismo a partir da ferida, ou pela detecção de atividade da toxina no exsudato da ferida ou soro.

2.5 Tratamento, prevenção e controle

Pacientes com botulismo necessitam das seguintes medidas terapêuticas (1) suporte ventilatório adequado, (2) eliminação do organismo do trato gastrointestinal, através do uso criterioso de lavagem gástrica e terapia com metronidazol ou penicilina e (3) uso de antitoxina botulínica trivalente contra as toxinas A, B e E para neutralizar toxinas circulantes na corrente sanguínea. A respiração artificial é extremamente importante para reduzir a mortalidade. Não se desenvolvem níveis protetores de anticorpos após a doença, portanto os pacientes são suscetíveis a múltiplas infecções.
A doença é prevenida destruindo-se os esporos nos alimentos (o que praticamente impossível, por motivos práticos), impedindo-se a germinação dos esporos (mantendo-se o alimento em um ph ácido ou estocado a 4ºC ou menos) ou destruindo-se a toxina pré-formada (todas as toxinas botulínicas são inativadas pelo aquecimento entre 60ºC e 100ºC durante 10 minutos). O botulismo infantil foi associado ao consumo de mel contaminado por esporos de C. botulinum, portanto crianças com menos de 1 ano de idade não devem comer mel.

2.6 Benefícios da substância botulínica

Os efeitos terapêuticos da toxina botulínica vêm sendo estudados há décadas. No início, a substância foi utilizada para tratamento de estrabismo e de espasmos involuntários da musculatura das pálpebras. Administrada em pequenas doses, a toxina vem sendo usada para tratar doenças relacionadas a contrações musculares indesejáveis.

Conclusões

O que podemos concluir é que o C. tetani e o C. botulinum, possuem o mesmo gênero, porém são de espécies diferentes, assim provocando uma doença diferente, com diferentes sinais e sintomas, sendo que o diagnóstico pode ser realizado por sorologia, e o tratamento realizado com antiinflamatórios e toxicas próprias.
O tétano e botulismo são doença que sensibilizam o sistema SNC, e o melhor modo de prevenção em relação ao botulismo seria evitar alimentos aparente deteriorados, e o tétano a melhor forma de prevenção é a vacinação, onde é disponibilizada gratuitamente pelo SUS.
São doenças preveníveis, então o papel de nós profissionais de saúde é de levar à informação a população, de forma educativa e didática estaremos educando a população.





















BIBLIOGRAFIA


LIVRO:

• MURRAY,Patrick R. [at.al]. Microbiologia Médica. 5ª Edição. Pgs: 393,398,399,400,401,402,403. Rio de Janeiro. Elsevier,2006.
  
• KONEMAN,Elmer W.[et.al] Diagnóstico Microbiológico.5ª edição. Pg:29. Guanabara Koogan. Rio de janeiro
  

Acadêmica:

Karen Quevedo